1. DNA去甲基化的方式？
答：有兩種方式: 1） 被動(dòng)途徑: 由于核因子N F 粘附甲基化的DNA , 使粘附點(diǎn)附近的DNA不能被完全甲基化, 從而阻斷DNM T1 的作用; 2） 主動(dòng)途徑: 是由去甲基酶的作用, 將甲基集團(tuán)移去的過(guò)程。在DNA 甲基化阻遏基因表達(dá)的過(guò)程中, 甲基化CpG 粘附蛋白起著重要作用。雖然甲基化DNA 可直接作用于甲基化敏感轉(zhuǎn)錄因子E2F、CREB、A P2、CM ycöM yn、N F2KB、Cmyb、Ets, 使它們失去結(jié)合DNA 的功能從而阻斷轉(zhuǎn)錄, 但是, 甲基化CpG 粘附分子可作用于甲基化非敏感轉(zhuǎn)錄因子（SP1、CTF、YY1） , 使它們失活, 從而阻斷轉(zhuǎn)錄。人們已發(fā)現(xiàn)5 種帶有恒定的甲基化DNA 結(jié)合域（MBD ） 的甲基化CpG 粘附蛋白。其中M ECP2、MBD1、MBD2、MBD3 參與甲基化有關(guān)的轉(zhuǎn)錄阻遏;MBD1 有糖基轉(zhuǎn)移酶活性, 可將T 從錯(cuò)配堿基對(duì)TöG 中移去,MBD4 基因的突變還與線粒體不穩(wěn)定的腫瘤發(fā)生有關(guān)。在MBD2 缺陷的小鼠細(xì)胞中, 不含M ECP1 復(fù)合物, 不能有效阻止甲基化基因的表達(dá)。這表明甲基化CpG 粘附蛋白在DNA 甲基化方式的選擇, 以及DNA 甲基化與組蛋白去乙酰化、染色質(zhì)重組相互聯(lián)系中的有重要作用。
2. DNA甲基化是什么？
 答：甲基化（DNA methylation） DNA甲基化是*早發(fā)現(xiàn)的修飾途徑，大量研究表明，DNA甲基化能引起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA構(gòu)象、DNA穩(wěn)定性及DNA與蛋白質(zhì)相互作用方式的改變，從而控制基因表達(dá)。 在甲基轉(zhuǎn)移酶的催化下，DNA的CG兩個(gè)核苷酸的胞嘧啶被選擇性地添加甲基，形成5－甲基胞嘧啶，這常見(jiàn)于基因的5＇-CG-3＇序列。大多數(shù)脊椎動(dòng)物基因組DNA都有少量的甲基化胞嘧啶，主要集中在基因5＇端的非編碼區(qū)，并成簇存在。甲基化位點(diǎn)可隨DNA的復(fù)制而遺傳，因?yàn)镈NA復(fù)制后，甲基化酶可將新合成的未甲基化的位點(diǎn)進(jìn)行甲基化。DNA的甲基化可引起基因的失活。 DNA甲基化主要形成5－甲基胞嘧啶（5-mC）和少量的N6-甲基嘌呤（N6-mA）及7－甲基鳥嘌呤（7-mG）
3. DNA甲基化發(fā)生在什么位置？ 
答：含有很多CpG 結(jié)構(gòu), 2CpG 和2GPC 中兩個(gè)胞嘧啶的5 位碳原子通常被甲基化, 且兩個(gè)甲基集團(tuán)在DNA 雙鏈大溝中呈特定三維結(jié)構(gòu)。基因組中60%～ 90% 的CpG 都被甲基化, 未甲基化的CpG 成簇地組成CpG 島, 位于結(jié)構(gòu)基因啟動(dòng)子的核心序列和轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)。有實(shí)驗(yàn)證明超甲基化阻遏轉(zhuǎn)錄的進(jìn)行。DNA 甲基化可引起基因組中相應(yīng)區(qū)域染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變化, 使DNA 失去核酶ö限制性內(nèi)切酶的切割位點(diǎn), 以及DNA 酶的敏感位點(diǎn), 使染色質(zhì)高度螺旋化, 凝縮成團(tuán), 失去轉(zhuǎn)錄活性。5 位C 甲基化的胞嘧啶脫氨基生成胸腺嘧啶, 由此可能導(dǎo)致基因置換突變, 發(fā)生堿基錯(cuò)配: T2G, 如果在細(xì)胞分裂過(guò)程中不被糾正,就會(huì)誘發(fā)遺傳病或癌癥, 而且, 生物體甲基化的方式是穩(wěn)定的, 可遺傳的。
4. DNA甲基轉(zhuǎn)移酶有哪些？
答：DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶有兩種: 1） DNM T1, 持續(xù)性DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶—— 作用于僅有一條鏈甲基化的
DNA 雙鏈, 使其完全甲基化, 可參與DNA 復(fù)制雙鏈中的新合成鏈的甲基化,DNM T1 可能直接與
HDAC （組蛋白去乙酰基轉(zhuǎn)移酶） 聯(lián)合作用阻斷轉(zhuǎn)錄; 2）DNM T3a、DNM T3b 從頭甲基轉(zhuǎn)移酶, 它們可甲
基化CpG, 使其半甲基化, 繼而全甲基化。從頭甲基轉(zhuǎn)移酶可能參與細(xì)胞生長(zhǎng)分化調(diào)控, 其中DNM T3b
在腫瘤基因甲基化中起重要作用。
5. DNA 甲基化的作用？
答：
1） 基因C →T 突變
DNA 甲基化引起基因突變的機(jī)制主要是由于DMT 催化反應(yīng)形成。DMT 可以加快C（胞嘧啶） 和
5mC 脫氨,封閉U（尿嘧啶） 的修復(fù),并且使U →T 改變,故DMT 促使CpG 序列的C →T 突變 。
抑癌基因p53 就是一個(gè)典型的例證。50% 實(shí)體瘤病人出現(xiàn)p53 基因突變。突變中24% 是CpG 甲
基化后脫氨引起的C→T 突變。
2） 影響基因錯(cuò)配修復(fù)
DNA 錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)（DNAmismatch repair system，MMR） 是指存在人類細(xì)胞中的一種修復(fù)DNA 堿
基錯(cuò)配的安全保障體系，它是由一系列特異修復(fù)DNA 堿基錯(cuò)配的酶分子組成。Ahujia 等研究發(fā)現(xiàn)MMR
缺陷時(shí),CpG 島的甲基化增強(qiáng),并認(rèn)為MMR 與DNA 甲基化有關(guān)。在基因錯(cuò)配修復(fù)過(guò)程中甲基化具有導(dǎo)
向識(shí)別作用,而在錯(cuò)配修復(fù)基因表達(dá)缺陷的原因中基因突變和基因啟動(dòng)子區(qū)的高甲基化是其主要原
因 。
3） 基因沉默
目前認(rèn)為,甲基化影響基因表達(dá)的機(jī)制有下列幾種： ①直接作用。基因的甲基化改變了基因的
構(gòu)型，影響DNA 特異順序與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合,使基因不能轉(zhuǎn)錄； ②間接作用。基因5′端調(diào)控序列甲
基化后與核內(nèi)甲基化CG 序列結(jié)合蛋白（methyl CG-binding p rotein）結(jié)合，阻止了轉(zhuǎn)錄因子與基因形成轉(zhuǎn)
錄復(fù)合物； ③DNA 去甲基化為基因的表達(dá)創(chuàng)造了一個(gè)良好的染色質(zhì)環(huán)境。DNA 去甲基化常與DNase
I 高敏感區(qū)同時(shí)出現(xiàn),后者為基因活化的標(biāo)志。
6. DNA 甲基化的檢測(cè)方法？
方法概括起來(lái)可分為三類：基因組整體水平的甲基化檢測(cè)、基因特異位點(diǎn)甲基化的檢測(cè)和新甲基化位
點(diǎn)的尋找。
1） 基因組整體水平甲基化分析
a） 高效液相色譜柱（HPLC）及相關(guān)方法
b） SssI 甲基轉(zhuǎn)移酶法
c） 免疫化學(xué)法
d） 氯乙醛法
2） 特異性位點(diǎn)的DNA 甲基化的檢測(cè)
a） 甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶（MS-RE）-PCR/Southern法 b） 直接測(cè)序法 c） 甲基化特異性的PCR（methylation-specific PCR, MS-PCR） d） 甲基化敏感性單核苷酸引物延伸（Ms-SnuPE） e） 結(jié)合重亞硫酸鹽的限制性內(nèi)切酶法（combined bisulfite restriction analysis，COBRA） f） 甲基化敏感性單鏈構(gòu)象分析（methylation-specific single-strand conformation analysis，MS-SSCA） g） 甲基化敏感性變性梯度凝膠電泳（methylation-specific denaturing gradient gel electrophoresis，MS-DGGE） h） 甲基化敏感性解鏈曲線分析（methylation-specific melting curve analysis，MS-MCA） i） 熒光法（Methylight） j） DNA微陣列法 k） 甲基化敏感性斑點(diǎn)分析（methylation sensitive dot blotassay，MS-DBA） l） 甲基化特異性多連接依賴性探針擴(kuò)（Methylation-Specific multiplex ligation-dependent probe amplification，MS-MLPA） 3） 甲基化新位點(diǎn)的尋找 a） 限制性標(biāo)記基因組掃描（restriction landmark genomic sCANning，RLGS） b） MBD（Methyl-CpG binding domain column chromatography，甲基化結(jié)合區(qū)）柱層析法 c） 聯(lián)合甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶的MBD（Combination of methylated-DNA precipitation ａnd methylation-sensitive restriction enzymes，COMPARE-MS）

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