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點擊次數：15034 發布時間：2013/7/12 11:22:30
激酶活性分析
蛋白激酶通常是多個信號轉導網絡的常見組分，它們影響了眾多負責生物反應的下游效應物，因此，評估某個特定激酶的活性可能為平行通路提供寶貴信息。生物學樣品中的激酶活性通常是在體外測定的，在ATP的存在下將免疫沉淀的激酶與外源底物共同孵育。之后通過一些報告系統來評估特定激酶對底物的磷酸化，包括顯色、放射性或熒光檢測。此外，R&D Systems還提供非放射性的Universal Kinase Activity Kit，能夠定量任何可產生ADP的激酶的活性。盡管我們能夠獲得有關特定激酶行為的信息，但評估細胞提取物中的酶活性僅僅揭開了信號通路的冰山一角。我們對蛋白如何被修飾還知之甚少，且體外活性分析也不能說明內源磷酸酶活性的潛在作用。磷酸化蛋白的直接檢測可能為細胞如何應對外界刺激提供更詳細的分析，因為磷酸化肽段的鑒定為蛋白的表達和功能狀態提供信息。
酶聯免疫吸附分析（ELISA）
ELISA已逐漸成為測定蛋白磷酸化的一種有力方法。ELISA的定量能力優于Western blot，且在調節激酶活性和功能的研究中表現出巨大的作用。這種微孔板形式的分析一般利用目的蛋白特異的捕獲抗體，與磷酸化狀態無關。隨后讓目的蛋白結合在抗體包被的分析板中，目的蛋白可以是純的，也可以是復雜的異質樣品（如細胞裂解液）中的一個組分。加入待分析的磷酸化位點特異的檢測抗體。這些分析通常設計為顯色或熒光檢測。產生的信號強度與*初樣品中存在的磷酸化蛋白的濃度成正比。與更為傳統的免疫印跡相比，磷酸化特異的ELISA技術具有一些優點。首先，利用經過校準的標準品，可輕松定量結果。其次，以三明治形式使用目的蛋白特異的兩個抗體，帶來了高的特異性。第三，ELISA的靈敏度更高允許使用更少量樣品，檢測低豐度的蛋白。*后，微孔板形式的通量比傳統的Western blotting要高得多。ELISA通常帶來了激酶活性的間接測定。不過，另一類ELISA技術使用固定化的捕獲抗體、底物和磷酸化底物的檢測方法，帶來激酶活性的更直接測定。
原創作者：上海恒遠生物技術發展有限公司
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