gel-elongation分析二型脂肪酸合成

型脂肪酸合成（fasii）是必不可少的細菌細胞活力。顯著性差異的細菌和人類在組織結構，酶，和所發揮的作用脂肪酸使這一途徑的一個有吸引力的目標抗菌藥物發現（參。2）。兩年銷售抗菌藥物這一目標的費邊酶是三氯生（防腐劑）和異煙肼（一種抗結核劑）（參3 , 4）。天然產品，淺藍菌素（參考文獻5）和thiolactomycin（參考文獻6）選擇性抑制縮合酶fabh和fabf /乙，二十多年前被發現。新的篩選努力與現有的化學修飾化合物已試圖找出更多的選擇和有效的抑制劑。確定選擇性抑制劑確定在篩選的努力，我們開發gel-elongation試驗使用原油細菌裂解液直接確定具體目標的脂肪酸合成酶抑制劑（參。7 , 8）。

材料

試劑

數碼地面電視從費雪（bp172-5）；β-巰基乙醇是從儀（161-0710）。[ 2-14c ]丙二酰輔酶A（60毫居里/濃度，珀金埃爾默，nec612），非加太（西格瑪，a7303）預處理3毫米數碼地面電視的冰上20分鐘，等分和儲存在- 80攝氏°淺藍菌素和thiolactomycin購自西格瑪。三氯生可以從塑料，003384。尿素，PVD F膜，10三/甘氨酸緩沖液和本地蛋白樣品緩沖購自美國伯樂。

設備

凝膠電泳儀，熒光屏和phosphorimager掃描儀

時間

2天。一天一個運行fasii法，解決它的凝膠和夜間轉移到PVD F膜蛋白。第二天揭露phosphorscreen蛋白綁定到聚偏氟乙烯膜和掃描圖像使用phosphorimager掃描儀

程序

1）fasii gel-elongation法是由preincubating 0.25 - 2µ克大腸桿菌或金黃色葡萄球菌裂解液與串行稀釋抑制劑在室溫下20分鐘在50µ我的緩沖區含有100毫米磷酸鈉（7），5毫米，1毫米，1毫米的核苷酸，核苷酸，150µ米數碼地面電視，5毫米ß-巰基乙醇，20µ米乙酰輔酶A或n-octanoyl-coa或任何其他�；�輔酶A需要，4%二甲基亞砜，8µ米非加太預處理技術。

2）的反應是由另外的10µ升的水稀釋[碳14 ]丙二酰輔酶A，使終濃度為4µ米丙二酰輔酶A。

3）反應是培養在37攝氏°30分鐘，對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的裂解液60分鐘。

4）反應后，10µ我（加10倍µ我原樣品緩沖）每個樣品直接應用到16 %聚丙烯酰胺凝膠含有一系列0.4米至4米尿素需要。

5）凝膠的解決和轉移到聚偏氟乙烯（聚偏二氟乙烯）膜，暴露在熒光屏和可視化利用phosphorimager掃描儀。

故障排除

關鍵步驟

尿素濃度是至關重要的分離acyl-acps鏈長度。活動的裂解液中不同的細菌菌株。因此，需要fasii活性試劑需要優化滴定。乙酰輔酶A不是一個理想的基板為金黃色葡萄球菌（參考文獻9）。

預期的結果

在細菌中，fabh催化首先縮合反應使用乙酰輔酶A和malonyl-acp產生acetoacetyl-acp。本產品是減少了導彈快艇，脫水的蠶豆/生產c4:1（Δ2）-非加太國家，進而減少了二次費邊使butyryl-acp（c4:0-acp）是基fabf /冷凝酶。淺藍菌素，選擇性fabf /乙抑制劑，在200µ克/毫升積累butyryl-acp和thiolactomycin（333µ克/毫升）抑制fabh和fabf /冷凝酶造成輕微的積累butyryl-acp離開一個廣大malonyl-acp未。三氯生（100µ克/毫升）治療導致的積累c4:1（Δ2）-非加太國家由于其抑制法幣。在凝膠延長分析利用大腸桿菌提取物（圖1），觀察抑制與平板霉素（167µ克/毫升）是類似于看到淺藍菌素，和不同的觀察與thiolactomycin和三氯生，表明平板霉素選擇目標fabf / B .同樣，滴定平板霉素的使用金黃色葡萄球菌的凝膠延長分析，與octanoyl-coa（c8:0）和丙二酰輔酶A作為基板，顯示一個集成電路~ 50 ~ 0.2µ克/毫升（圖2）。在較高濃度的平板霉素的積累malonyl-acp觀察，表明這種抑制劑不fabd一塊，丙二酰輔酶A：非加太轉酰基酶。低濃度的平板霉素生產部分抑制伸長活動和積累c2n：0-acp

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