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英文名稱：Human adrencocorticotropic hormone,ACTH ELISA KIT
產品規格：96T/48T
品牌：RD/RB/IBL
類別：ELISA試劑盒/人的ELISA檢測試劑盒
產品特點：For laboratory use only,Not for drug or other uses.本公司可提供免費代測服務.
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操作步驟
方法一 用于檢測未知抗原的雙抗體夾心法:
1. 包被：用0.05M PH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質含量為1～10μg／ml。在每個聚苯乙烯板的反應孔中加0.1ml，4℃過夜。次日，棄去孔內溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘。（簡稱洗滌，下同）。
2. 加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應孔中，置37℃孵育1小時。然后洗滌。（同時做空白孔，陰性對照孔及陽性對照孔）。
3. 加酶標抗體：于各反應孔中，加入新鮮稀釋的酶標抗體（經滴定后的稀釋度）0.1ml。37℃孵育0.5～1小時，洗滌。
4. 加底物液顯色：于各反應孔中加入臨時配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分鐘。
5. 終止反應：于各反應孔中加入2M硫酸0.05ml。
6. 結果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結果：反應孔內顏色越深，陽性程度越強，陰性反應為無色或極淺，依據所呈顏色的深淺，以“+”、“-”號表示。也可測O?D值：在ELISA檢測儀上，于450nm（若以ABTS顯色，則410nm）處，以空白對照孔調零后測各孔O?D值，若大于規定的陰性對照OD值的2.1倍，即為陽性。
方法二 用于檢測未知抗體的間接法：
1、用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1～10μg／ml，每孔加0.1ml，4℃過夜。
2、次日洗滌3次。加一定稀釋的待檢樣品（未知抗體）0.1ml于上述已包被之反應孔中,置37℃孵育1小時,洗滌。同時做空白、陰性及陽性孔對照于反應孔中，加入新鮮稀釋的酶標第二抗體（抗抗體）0.1ml，37℃孵育30-60分鐘，洗滌,一遍用DDW（超純水）洗滌。其余步驟同“雙抗體夾心法”的4、5、6。
3. 加底物液顯色：于各反應孔中加入臨時配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分鐘。
4. 終止反應：于各反應孔中加入2M硫酸0.05ml。
5. 結果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結果：反應孔內顏色越深，陽性程度越強，陰性反應為無色或極淺，依據所呈顏色的深淺，以“+”、“-”號表示。也可測O?D值：在ELISA檢測儀上，于450nm（若以ABTS顯色，則410nm）處，以空白對照孔調零后測各孔O?D值，若大于規定的陰性對照OD值的2.1倍，即為陽性。
試劑器材
1. 試劑
（1） 包被緩沖液（PH9.6 0.05M碳酸鹽緩沖液）:
NaCO31.59克 NaHCO3 2.93克 加蒸餾水至1000ml
（2） 洗滌緩沖液（PH7.4 PBS）：0.15M KH2PO4 0.2克 Na2HPO4?12H2O 2.9克 NaCl 8.0克KCl 0.2克 Tween-20 0.05％ 0.5ml 加蒸餾水至1000ml
（3） 稀釋液:牛血清白蛋白（BSA） 0.1克 加洗滌緩沖液至100ml 或以羊血清、兔血清等 血清與洗滌液配成5～10％使用。
（4） 終止液（2M H2SO4）：蒸餾水178.3ml，逐滴加入濃硫酸（98％）21.7ml。
（5） 底物緩沖液（PH5.0磷酸棗檸檬酸）:0.2M Na2HPO4（28.4克／L） 25.7ml 0.1M 檸檬酸（19.2克／L） 24.3ml 加蒸餾水50ml。
（6） TMB（四甲基聯苯胺）使用液:TMB（10mg／5ml無水乙醇） 0.5ml底物緩沖液（PH5.5） 10ml0.75％H2O2 32μl
（7） ABTS使用液:ABTS 0.5mg 底物緩沖液（PH5.5） 1ml 3％H2O2 2μl
（8） 抗原、抗體和酶標記抗體。
（9） 正常人血清和陽性對照血清。
2. 器材:
（1） 聚苯乙烯塑料板（簡稱酶標板）40孔或96孔，ELISA檢測儀，50μl及100μl加樣器，塑料滴頭，小毛巾，洗滌瓶。
（2） 小燒杯、玻璃棒、試管、吸管和量筒等。
（3） 4℃冰箱，37℃孵育箱。
注意事項
1. 正式試驗時，應分別以陽性對照與陰性對照控制試驗條件，待檢樣品應作一式二份，以實驗結果的性。有時本底較高，說明有非特異性反應，可采用羊血清、兔血清或BSA等封閉。
2. 在ELISA中，進行各項實驗條件的選擇是很重要的，其中包括:
（1） 固相載體的選擇：許多物質可作為固相載體，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纖維素等。其形式可以是凹孔平板、試管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何種載體，在使用前均可進行篩選：用等量抗原包被，在同一實驗條件下進行反應，觀察其顯色反應是否均一性，據此判明其吸附性能是否良好。
（2） 包被抗體（或抗原）的選擇：將抗體（或抗原）吸附在固相載體表面時，要求純度要好,吸附時一般要求PH在9.0～9.6之間。吸附溫度，時間及其蛋白量也有一定影響,一般多采用4℃18～24小時。蛋白質包被的*適濃度需進行滴定：即用不同的蛋白質濃度（0.1、1.0和10μg／ml等）進行包被后，在其它試驗條件相同時，觀察陽性標本的OD值。選擇OD值而蛋白量*少的濃度。對于多數蛋白質來說通常為1～10μg／ml。
（3） 酶標記抗體工作濃度的選擇：首先用直接ELISA法進行初步效價的滴定（見酶標記抗體部份）。然后再固定其它條件或采取“方陣法”（包被物、待檢樣品的參考品及酶標記抗體分別為不同的稀釋度）在正式實驗系統里地滴定其工作濃度。
（4） 酶的底物及供氫體的選擇：對供氫體的選擇要求是價廉、安全、有明顯地顯色反應，而本身無色。有些供氫體（如OPD等）有潛在的致癌作用，應注意防護。有條件者應使用不致癌、靈敏度高的供氫體，如TMB和ABTS是目前較為滿意的供氫體。底物作用一段時間后，應加入強酸或強堿以終止反應。通常底物作用時間，以10-30分鐘為宜。底物使用液必須新鮮配制，尤其是H2O2在臨用前加入。
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